C. Quelles sont les conditions optimales pour une bonne Culture in vitro ? (Annexe 1 : TP)

    
1. Constitution du milieu de culture


        Tout d’abord, l’explant doit être le plus sain possible pour que la plante pousse sans facteur limitant et ne soit pas malade. Il doit être stérilisé pour éviter toute contamination.

        Un milieu de culture adéquat stérilisé est également nécessaire. Celui-ci est très important car ce sera le milieu de vie de la plante. Le plus utilisé est le milieu Murashige et Skoog (MS). Il est utilisable pour toutes les cultures in vitro. Il doit répondre aux besoins essentiels  de l’explant qui y sera repiqué et permettra à celui-ci de se développer.

sans-titre-6-1.jpgCoulage du milieu (Nos TP)   


        Pour cela le milieu de culture doit contenir des minéraux tels que :

  • Les macroéléments : Ce sont des éléments présents en grande quantité tels que l’azote, l’hydrogène ou encore le calcium et le chlorure. Le phosphore (P) est utilisé par la plante. Chaque macroélément à un rôle particulier pour le développement de la plante comme par exemple le calcium qui permet la solidité de la paroi pectocellulosique*.
  • Les micro-éléments : Ce sont des oligoéléments présents en petite quantité utilisés dans des réactions chimiques telles que l’oxydoréduction*. Ils servent aussi de catalyseurs*.
  • Les vitamines : Ce sont des substances organiques reconnues pour stimuler la croissance. Elles sont particulièrement utiles en micro propagation lorsque seul un fragment de la plante est utilisé pour générer une plante entière.
  • L’agar-agar : C’est une gélatine à base d'algues qui permet de solidifier le milieu.
  • Une source carbonée : Généralement du saccharose permettant de relancer la photosynthèse
  • L’eau et un pH légèrement acide pour éviter la croissance des micro-organismes et permet l’absorption des nutriments. (5.2~5.8)


        Des régulateurs de croissances peuvent être ajoutés pour orienter la culture : ce sont les phytohormones*. Parmi les phytohormones on trouve l’auxine qui est produite par la plante et qui est indispensable au développement de celle-ci. Son action dépend très fortement à la fois de sa concentration et du tissu sur lequel elle agit. Par exemple, une même concentration peut inhiber le développement d’un bourgeon alors qu’elle favorisera l’élongation d’une tige. Les conséquences sur un même organe peuvent varier selon les plantes.

L’auxine :

  • Stimule la croissance
  • Régule la division et différenciation cellulaire
  • Favorise la rhizogenèse* et l’élongation cellulaire

         Il existe aussi les cytokinines qui sont indispensables au développement de la plante. Elles stimulent les divisions cellulaires et la croissance des bourgeons axillaires. Les cytokinines régulent la morphogénèse et contribuent au renouvellement de la chlorophylle. Cette hormone est synthétisée au niveau de l'apex racinaire.

Les cytokinines :

  • Stimule la division cellulaire
  • Favorise la croissance cellulaire
  • Régule la différenciation cellulaire (bourgeons et racines)
  • Active de la production de
    chlorophylle
  • Inhibe la sénescence* des feuilles

         Le développement des différentes parties d’une plante en culture in vitro est lié aux  concentrations en auxine et cytokinine. Ceci est appelé la balance
hormonale. Si les concentrations d’auxine sont plus élevées que celles de la cytokinine, cela va favoriser la rhizogénèse (racines). En revanche, si les concentrations d’auxine sont moins élevées que celle de la cytokinine, l’explant va évoluer vers une fonction caulogène* (bourgeons). Enfin, si les concentrations en auxine et en cytokinine sont équivalentes, l’explant a un comportement calogène* (cal).

sans-titre-7-1.jpg


Balance hormonale

2. Conditions de travail


        La culture in vitro nécessite des conditions d’asepsie. Tout le matériel nécessaire doit être exempt de tous germes et micro-organismes. Pour cela on utilise du matériel stérile comme des tubes en verre, scalpels ou boîtes de Pétri. Il est aussi nécessaire de se laver régulièrement les mains avec de l’alcool. On doit travailler sous hotte vertical à flux laminaire stérilisée au préalable avec de l’alcool ou près d’un bec bunsen comme nous l’avons fait lors de notre TP au lycée. Pour stériliser le matériel on utilise un autoclave mais aussi un mini-four à billes à 250°C dans lequel on met les outils après chaque étape de la mise en culture. Une fois que les explants sont placés dans leurs tubes stériles ils sont placés dans une chambre de culture climatisée avec une température d’environ 22°C, une humidité maintenue à 50-60% et une photopériode* de 16 heures de lumière et de 8 heures d’obscurité.

sans-titre-8.jpg

Hotte à flux laminaire (TP) sans-titre-9.jpgAutoclave (TP)sans-titre-10.jpgfour à bille (TP)sans-titre-12.jpgchambre climatisée

 


        Au cours du temps, la culture in vitro réalisé par l’Homme et devenue de plus en plus performante et de nombreuses techniques ont été mises au point chacune possédant de nombreux atouts mais aussi des limites.



 

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